凍結切片のISH

buffers & media, microscopy, molecular biology

固定

  1. 4% PFA / PBSで灌流固定
  2. 組織を切り出し、数時間浸漬固定
  3. 30% sucrose / PBS、4℃、O/N
  4. OCTコンパウンドに包埋しLN2で凍結（クラックできないよう注意）
  5. 10µmでクライオスタット切片


プローブ

  1. プラスミドをWizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製（5ml LBのO/Nカルチャー、Lysateは2回遠心、Washに70% EtOH追加）
  2. Miniprep全量をFermentas FastDigestで完全に直鎖化（ゲルでチェック）
  3. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up Systemで精製（Washに70% EtOH追加、溶出は2×15µl）（スペックで濃度検定、1µgの容量を算出、PCIは非推奨）
  4. DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)（Roche）でプローブを合成
  5. オプション：アルカリ分解
  6. + 1µl 20mg/ml glycogen、+ 0.5vol 7.5M NH4OAc、+2.5vol EtOH、-20℃ O/N
  7. 遠心、70% EtOHで洗い、遠心（PCIは不適。有機相にプローブがくる）
  8. 500µl HYBに溶解

RNAのアルカリ分解

  1. 50µlのプローブ溶液に、30µlの200mM Na2CO3、20µlの200mM HaHCO3を加える
  2. 60℃でt分間：t = (L0 -Lf) / (K × L0 × L1)、K =0.11、L0=初期長 (kb)、Lf=目的長 (kb)
  3. 500 kbに

ハイブリ

  1. PBS、2 min
  2. PAPペンで枠を描く
  3. 1 µg/ml ProK / PBS, 30min、37℃（0.1〜10）
  4. 2×SSC、2×5 min
  5. 100µl HYB、60 min、37℃（37〜50℃）
  6. 100µl Probe / HYB (1:10), 16h、37℃（37〜50℃）
  7. 2×SSC、2×5 min、37℃
  8. 60% formamide、0.2×SSC、3×5min、37℃
  9. 2×SSC、2×5 min

発色

  1. PBST、5 min
  2. BLOCK、30 min
  3. 100µl 1:200 α-DIG / Block（遠心して沈渣を除く）、2h
  4. PBST、2×5 min
  5. Al-P Bfr、5 min
  6. BCIP/NBT（Roche）、暗所、液が色づいたら交換、発色するまで（〜O/N）

溶液

  • PBS：タカラのDPBSのタブレット
  • PBST：0.1% Tween-20 / PBS
  • PFA：20g PFA、100mlの水、65℃のヒートブロックで過熱し、200µlの1N NaOH添加、だいたい溶解したら濾過する
  • HYB：4×SSC、10%デキストラン硫酸、1×デンハート液、2mM EDTA、50% formamide、0.5 mg/ml torula RNA
  • BLOCK：2％ NGS、1％ブロッキング試薬（Roche）
  • Al-P Bfr：20ml 1M Tris-HCL, pH9.5、10ml 1M MgCl2、4ml 5M NaCl、2ml 20%Tween-20、2ml 20% Triton X-100、240µg levamisole、水を加えて200ml

RNAの扱い

  • 手袋着用。
  • 容器は滅菌済みの製品またはオートクレーブしたもの。
  • 手袋をした手やマイクロピペットなどはRNase Awayで処理。
  • 水は分子生物学用の1ml入り製品、またはDEPC処理した水。
  • 電気泳動装置は洗剤でよく洗い、ゲルは使うときに作る。DNAはSYBR Safeを、RNAの反応液はEtBrをバッファに加えて泳動