試薬
50mM NaOH
KOD FX Neo (TOYOBO) 含 Buffer, dNTPs (←KOD FXでも可)
Agarose LE (Wako)
50x TAE (Nacalai)
Gene Ladder 100 (Nippon Gene)
GreenView Nucleic Acid Gel Stain (RELYON)
プロトコール
1.5mLチューブ、8連PCRチューブどちらでも可
PCR反応時はApplied BIosystems® MicroAmp® 8-Tube Strips等を使う
1. 適切な処置にて組織片、スワブを回収する
2. サンプルに50mM NaOH 50μLを加える（サンプルが浸っていることを確認）
3. 98℃ 5min
4. 室温に戻す
5. スピンダウン
6. 上清10μL回収 (=Lysate)
←サンプルの周囲はDNAが壊れて粘性があるので吸わないように気をつける
7. Lysate以外を混ぜる （+10%目安で作成して分注する）
2x Buffer 10μL
dNTPs 4μL
Primer(Fw) 0.2μL
Primer(Rv) 0.2μL
KOD FX Neo 0.4μL
DDW 3.2μL
Total 18μL
※Primerのペア
系統：13, 65
→ Fw: ex4-465F Rv: ex4-409R
系統：ep5
→ Fw: ex29+564F Rv: ex29+871R
8. 18μL分注
9. +2μL Lysate
10. よく混ぜてスピンダウンした後、サイクラーにセット
11. 反応条件
Pre 94℃ 2min
Den 98℃ 10sec
Ann xx℃ 30 sec
Ext 68℃ xx sec x30cycle
Post 4℃ ∞
※プログラム作成済なので、13, 65は「1365」, ep5は「ep5」でPCRすればOK
12. ゲル作成
1.5％ゲル
1x TAE 50 mL
Agarose LE 0.75 g
をBench Pintに入れて電子レンジで加熱
（※吹きこぼれる前に1回止める）
13. + 5 μL GreenView Nucleic Acid Gel Stain
14. トレイに流し込む、コーム(25 well)をさす、ゲルを固める
=====(固まるまで20~30分)=====
15. PCR反応液 20 μL + 2μL Dye
16. ゲルにapply する 10μL/well
17. 端にmarkerをapplyする5μL/well
18. 泳動 100V 25min (※必ず設定のチェックを行う！！特に電流の向き)
19. 結果を判定する
